完成单位：基础部
完 成 人：高 峰 张海锋 马 恒 王海昌 胡大海 李 嘉 张全江
郭文怡 吕根法 王跃民 马新亮
获奖时间：2008年陕西省科学技术一等奖
项目简介：
本项目属于应用基础研究。本课题组自1998年始，在国家自然科学基金等资助下，对胰岛素在缺血性心脏病心肌保护中的作用及其机制进行了较系统和深入的研究，获得数项首创性发现，并为国外多个实验室所证实。项目主要内容：
1. 首次发现胰岛素除代谢调节外，还可通过激活PI3K-Akt-eNOS（磷脂酰肌醇3-激酶－蛋白激酶B－内皮型一氧化氮合酶）信号机制抑制缺血／再灌注（I/R）心肌细胞凋亡，促进心肌存活及功能恢复；该发现把胰岛素与内源性eNOS-一氧化氮（NO）系统联系起来，课题组据此提出胰岛素激活细胞“生存信号”保护心肌新机制。论文在Circulation上发表，国际权威美国科技情报研究所（ISI）最近来函，通知并祝贺我们该论文成为被引用率最高的“1％最有影响的论文”。
2. 发现胰岛素是GIK保护缺血心肌的关键成分，据此提出GIK心脏保护作用的新机制——胰岛素学说。发现胰岛素通过激活上述“生存信号”使血管内皮细胞NO生成增多，抑制冠脉内皮细胞凋亡，改善冠脉舒张功能，据此提出胰岛素心血管保护的“硝基酯样”效应，即通过促进NO生成恢复冠脉舒张功能，保护缺血心肌。Cardiovasc Res为此发表述评，高度评价这一发现。
3. 发现老龄及自发性高血压大鼠存在心肌胰岛素抵抗，这与胰岛素不能有效激活心肌Akt-eNOS有关，提示胰岛素激活的细胞“生存信号”不仅直接参与心血管保护，该信号系统障碍还可直接导致心血管系统胰岛素抵抗，并进一步引起高血压、冠心病等心血管疾病的发生。而长期有氧运动可增强胰岛素保护缺血心肌的作用，其机制与增强心肌对胰岛素的敏感性有关。该结果不仅揭示了胰岛素抵抗导致心血管疾病的新机制，还为运动裨益心血管健康提供了新的理论依据，论文发表于Cardiovasc Res，同期杂志再次发表述评肯定我们这一发现。
论文发表于国际心血管最权威杂志Circulation（IF 12.56）等，被N Engl J Med（国际医学界最权威杂志）等广泛引用（>400次）。欧洲心脏学会会刊Cardiovasc Res和《中华内科杂志》为我们工作发表专论，评价上述发现“为胰岛素研究作出了新的重要贡献”。上述发现已被写入心脏病学专著。本课题受6项国家自然科学基金及国家杰出青年科学基金资助，自1998年起历时十年完成。
缺血性心脏病（亦即冠心病）是严重威胁人类健康的“头号杀手”。随着物质文明的发展，人们吃得越来越好，动得越来越少，压力越来越大，冠心病的发病率也在不断上升。早在上世纪六、七十年代，美国就有学者称冠心病为“时代的瘟疫”。而现在，这股瘟疫已悄然向我们发展中国家袭来。看，著名数学家华罗庚、俄罗斯联邦前总统叶利钦、著名相声演员马季、侯耀文都因患冠心病相继离我们而去，我们不得不感叹生命的脆弱，我们还能失去多少？2006年WHO数据显示：全球范围内约25%的老年人患有冠心病，仅此单一疾病致死人数就占到总死亡人数的16%。近年来随着国人生活水平的提高，IHD也成为危害国人健康的最重要疾病之一，每年医疗费用超过150亿。因此，彻底阐明其发病机制并寻求有效的治疗措施，是当今医学界亟待攻克的一项重要课题。
近年来一系列临床研究发现：一旦心血管系统不能正常接受到胰岛素信号（IR），就更易导致高血压、冠心病等心血管疾病，换句话说，IR是上述重大心血管疾病的共同病理生理基础——这就是近年提出的著名的“共同土壤”学说（IR是多种心血管疾病的共同土壤）。该现象提示，胰岛素对正常心血管活动的维持至关重要，一旦心血管系统不能正常接受到胰岛素信号就会导致心血管疾病。那么，为什么缺少了胰岛素，就容易罹患各种心血管疾病？我们知道，胰岛素是一经典的代谢调节激素，除了代谢调节以外，胰岛素对心血管系统是否还有其他作用？如果有，其机制又是什么？我们希望通过研究并阐明上述问题，能帮助我们从防治胰岛素抵抗角度找到更有效保护缺血心脏的策略和措施。本研究在整体动物实验，采用大鼠、兔以及与临床更接近的大动物犬定量心肌缺血/再灌注（MI/R）模型，研究胰岛素对冠脉循环、心脏功能及心肌梗死等的影响。并进一步通过离体实验分析机制：在离体心脏、分离单心肌细胞、分离冠脉血管、与胰岛素抵抗密切相关的线粒体等，结合心肌损伤-心脏功能，探讨胰岛素心血管作用的信号转导机制，寻找其中的关键信号分子或途径，期望以此作为防治胰岛素抵抗的靶点。得到以下主要结果和发现：
首先我们在大鼠和兔的MI/R模型上发现，与生理盐水对照组相比，再灌注时给予胰岛素均可显著减小心肌梗死面积。这是大鼠MI/R后心脏切片，由图中可见再灌注时给予GIK或胰岛素可显著降低心肌梗死范围（图中白色梗死区明显减小）。进一步研究显示，胰岛素抑制MI/R心肌细胞凋亡（表现为DNA梯减少及凋亡指数降低）。在分离的心肌细胞对其机制进一步研究。追踪一氧化氮（NO）生成的上游信号转导通路发现，胰岛素是通过PI3K-Akt-eNOS（磷脂酰肌醇3-激酶－蛋白激酶B－内皮型一氧化氮合酶）信号途径使心肌NO生成增加、进而抑制MI/R心肌细胞凋亡。最重要的是，我们首次发现胰岛素可激活心肌内源性eNOS–NO发挥抗凋亡作用。
据此，我们提出，胰岛素具有不依赖于代谢调节、直接激活PI3K-Akt-eNOS为主的细胞“生存信号”抑制缺血／再灌注心肌凋亡、促进心肌存活的细胞保护新机制。那么，胰岛素抗凋亡、减小心肌梗死有什么临床意义呢？我们很快想到了含有胰岛素的葡萄糖-胰岛素-钾极化液GIK。在整体水平，胰岛素及GIK均可减少MI/R大鼠心肌梗死范围。对其机理的进一步研究，我们发现很有意思的现象：胰岛素可抑制MI/R心脏冠脉内皮细胞凋亡，同时促进冠脉内源性NO释放。在离体培养的内皮细胞中，进一步证明了胰岛素抑制MI/R内皮细胞凋亡与激活内源性eNOS-NO系统有关。由于传统的硝基酯类舒血管药物（如硝酸甘油）就是通过最终释放NO扩张冠脉、改善心肌缺血。而我们的实验结果表明GIK中的关键成分胰岛素可通过激活心血管内源性eNOS-NO系统使NO 生成增加，产生类似硝基酯类药物的作用，保护缺血心脏。
我们还发现老年大鼠心肌也存在胰岛素抵抗，表现为葡萄糖摄取明显下降和心肌收缩对胰岛素的反应性显著降低；同时伴有胰岛素刺激的eNOS活性减少和线粒体功能下降。而有氧运动能通过上调Akt-eNOS信号路径增强心肌对胰岛素刺激的收缩功能的反应性，改善心肌线粒体功能。这些结果显示，Akt-eNOS信号通路的异常在衰老所诱发的胰岛素抵抗中具有重要作用。不仅如此，长期有氧运动还可通过上调Akt-eNOS信号通路增强胰岛素保护缺血心肌的作用，表现为心肌梗死面积的进一步降低和凋亡心肌细胞数目的减少。上述结果提示，老年大鼠存在心肌胰岛素抵抗，其机制与Akt-eNOS信号系统障碍有关，而有氧运动可通过增强该信号有效改善胰岛素敏感性，进而增强胰岛素的心肌保护作用。
创新点：
首次发现胰岛素除代谢调节外，还可直接激活细胞“生存信号”，即PI3K-Akt-eNOS信号机制，抗凋亡、保护缺血心脏，揭示了胰岛素对心血管作用的一个全新机制。
该“生存信号”系统障碍可直接导致胰岛素抵抗、诱发心血管疾病；而有氧运动可上调“生存信号”，增强胰岛素敏感性及其对缺血心脏的保护作用。这进一步反证了胰岛素的“生存信号”在心血管保护中的重要作用。
临床上，胰岛素除用于糖尿病治疗外， 含胰岛素的极化液还常用于急性心肌梗死（AMI）等的辅助治疗。自1962 年Sodi-Pallares 发现并首次报道GIK可减少AMI患者心律失常发生率以来，GIK在临床已断续应用四十余年，其疗效长期存有争议。通常认为GIK有两种作用机制：一是六十年代Sodi-Pallares提出的补充K+稳定细胞膜电位的“极化学说（polarizing theory）”，二是七十年代初著名心脏病学家Opie提出的“葡萄糖学说（glucose hypothesis）”。上述两种机制均把胰岛素作为GIK中的“辅剂”（促进K+进入细胞，或促进细胞摄取和代谢葡萄糖）。我们课题组在兔、犬等多种动物MI/R实验中确证，GIK有明确的心肌保护作用，胰岛素（而非K+或葡萄糖）是GIK心肌保护作用的关键。据此，申请者提出GIK心脏保护作用的新机制——胰岛素学说（insulin theory），其核心为“胰岛素是GIK发挥细胞保护作用的关键成分”。国际著名心脏病学家、GIK作用机制“葡萄糖学说”提出者Opie教授以“The glucose hypothesis: Updated or outdated? Role of insulin”为题撰文，首肯了我们提出的GIK作用机制的“胰岛素学说”。
本研究在国际心血管顶级杂志《循环》等权威杂志发表系列论文30篇，其中13篇SCI论文中，最高影响因子为12.75，9篇影响因子大于4。另外，培养硕士生14名、博士生12名、博士后1名以及国家杰出青年科学基金获得者1名。研究结果应邀在国际心脏病研究院第14届学术年会暨2008年世界心脏病大会等国际学术会议作大会报告或专题报告7次。部分工作获美国急诊医学会 “最佳基础研究奖”、陕西省第九届自然科学优秀学术论文一等奖等。
由于以往对GIK作用机制认识的局限，大大限制了其在临床更广泛、更有效地应用。我们的研究显示，传统的GIK疗法在给药时间、剂量等方面可能均有待改进和完善。比如，新发现GIK有显著的抗凋亡作用，而急性心肌梗死主要在发病早期缺血梗死灶有大量心肌细胞发生凋亡，后期则以心肌坏死为主，因此GIK只有在发病早期给予才能发挥最佳疗效；此外，输注GIK治疗AMI 时严格控制血糖亦很重要。此外，GIK／胰岛素新作用机制的发现，大大扩展了GIK的应用范围，我们新近观察到，GIK的细胞保护作用并不局限于心肌，GIK对急性肝损伤、创伤及烧伤组织修复等均有良好疗效（已获国家发明专利）。
本课题在国际杂志（SCI）发表论文13篇，迄今被他引391次（SCI）。 其中被 Physiological Reviews、Endocrine Reviews、Nature Review of Drug Discovery等影响因子>20的国际权威杂志广泛引用，被影响因子>10的杂志引用40余次。上述工作被New Engl J Med在“医学新进展（Progress in Medicine）”栏目综述引用。著名心脏病学家、英国伦敦大学医学院名誉教授DM Yellon在J Am Coll Cardiol（IF 9.70）“新观点（VIEWPOINT）”专栏发表的关于胰岛素研究新进展的综述中5次提到了课题组的工作。美国学者Das在胰岛素研究进展综述中（Curr Opin Crit Care，2003）评价课题组在GIK及胰岛素新作用机制的发现“of outstanding interest”。欧洲心脏学会（ESC）会刊Cardiovasc Res在2006年第1期以封面文章发表了课题组关于胰岛素保护冠脉血管的论文，并为此工作发表述评（Editorial），认为该发现揭示了“胰岛素具有比以往所知对缺血心脏更重要的保护作用”。《中华内科杂志》在2003年第3期卷首为课题组在胰岛素研究的新发现发表了题为“极化液、胰岛素保护缺血／再灌注的新机制——又一个老药新观点的典范”的专论。课题组发现的GIK及胰岛素的新作用及机制被写入新出版的心脏病学专著。研究成果被欧洲心脏学会（ESC）和欧洲糖尿病学会（EASD）共同发表的《糖尿病、前糖尿病及心血管病防治指南（Guideline）》（European Heart Journal，2007）及美国心脏学会（AHA）《高血糖与急性冠脉综合征》科学报告（Circulation，2007）引用和收录。美国Nova Science出版社主编Frank Columbus邀请课题组参加Cell Apoptosis Research一书的编写。
第一完成人简介：
高峰，第四军医大学基础部副主任，生理学教研室副主任，教授、博士生导师。教育部长江学者奖励计划特聘教授，国家杰出青年科学基金获得者。国际心脏学院（IAC）学术顾问委员会委员。近年主要从事胰岛素对心血管保护作用及机制的研究，发现胰岛素除代谢调节外直接激活“生存信号”细胞保护新机制，以第一或通讯作者在Circulation、Cardiovasc Res等SCI杂志发表论文23篇，被N Engl J Med等SCI杂志他引逾800次。担任 Cardiovascular Research（IF 6.12）和 Apoptosis（IF 4.49）杂志编委，Circulation等十多个SCI杂志审稿人，中国生物物理学会理事，《心脏杂志》常务副主编等。
