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2006年陕西省科学技术一等奖---Notch信号途径对细胞分化的调控及其机理的研究

2010-11-16 22:15 教学科研办 点击:[]

完成单位:基础部

:韩      秦鸿雁    王冀姝          梁英民          李军林

李军锋

获奖时间2006年省科学技术一等奖

项目简介

细胞分化是多细胞生物个体发育过程中细胞多样性产生的基础,其异常是多种人类疾病如肿瘤、神经变性疾病、自身免疫病等的核心环节。Notch信号途径是调控细胞分化的重要信号途径之一,可调控多种前体细胞和干细胞的增殖和分化,并与多种肿瘤和神经变性性疾病相关。在哺乳类有四种Notch受体,其信号均由转录因子RBP-J转导。我们对转录因子RBP-J的功能和活性调控进行了研究,取得了以下成果:

①首次建立了转录因子RBP-J的条件性基因剔除小鼠。表型分析表明,RBP-J可以介导Notch信号途径对淋巴祖细胞、转换B细胞、辅助性T细胞以及表皮干细胞的分化的调节。

②筛选了RBP-J结合蛋白KyoT2的相互作用分子,并对KyoT2相互作用分子对RBP-J的调控作用进行了研究,发现KyoT2可以将转录共抑制物PcG蛋白募集到RBP-J,从而抑制RBP-J的转录活性,提示PcG蛋白可对Notch的转录活性进行表观遗传学“记忆”。发现KyoT2可以和蛋白质SUMO化修饰系统的E3连接酶PIAS1相互作用,提示SUMO化修饰可能在RBP-J的转录调控中发挥重要作用。

③建立了RBP-J相互作用蛋白MINT基因剔除小鼠,并发现MINT在小鼠胚胎发育中可以调节多种器官的发生,并可以在体外和体内拮抗Notch的作用。利用酵母双杂交系统筛选得到了新MINT相互作用蛋白,发现MINT可以和多种信号转导分子和转录因子相互作用。深入研究了MINTCRYBP1的相互作用,发现MINT可以通过CRYBP1结合于II型胶原的增强子并抑制II型胶原的转录。这种转录抑制依赖于组蛋白脱乙酰化酶活性,提示MINT通过其C末端的SPOC结构域将HDAC募集到II型胶原增强子发挥转录抑制作用。

④建立了根据蛋白质细胞内定位进行功能性基因克隆的方法,对小鼠cDNA文库进行了筛选,得到大量核定位和分泌性蛋白的基因片段用于进一步分析。

项目发表国际论文11篇,包括Nucleic Acids ResJ Biol Chem等。论文引用共计220次。研究成果多次在国际和国内学术会议上交流。先后获得《郑集基金奖励优秀论文》,陕西《青年优秀论文》,全军《青年优秀论文》和《陕西省优秀博士论文》。

在多细胞生物中,细胞分化是其生命过程的基本现象之一。正常的细胞分化是产生细胞多样性的基础,在胚胎发育以及器官功能的建立中发挥重要作用;而异常分化常可引起肿瘤、先天性发育异常,以及器官功能障碍等疾患。因此研究细胞分化调控对于基础医学和临床医学均具有重要意义。

Notch信号途径是调控细胞分化十分重要的信号途径之一。Notch1916年由现代遗传学的奠基人Morgan在果蝇中鉴定。研究表明,Notch可通过介导细胞-细胞直接相互作用,使前体细胞或干细胞选择两种分化方向中的一种,抑制其向另一种方向分化。Notch对分化的调控具有两个显著的特征。一是其保守性,从果蝇到人类,Notch信号途径从结构到功能上都是高度保守的;二是其普遍性,可在多种细胞的分化中发挥作用。研究Notch信号途径对细胞分化的调控及其机理的认识具有普遍的意义。然而,以往对Notch信号途径的研究还未能全面阐述Notch在哺乳动物中的功能和作用机理。其主要问题在于:①Notch信号途径的主要分子的基因剔除往往引起小鼠在早期胚胎阶段死亡,因此无法利用这类手段研究Notch在诸如器官发生、干细胞分化等方面的功能;②在哺乳类存在多种在表达分布上重叠、在功能上代偿的Notch受体和配体,因此单纯一种受体或配体的基因剔除难以解释整个Notch信号途径的功能;③Notch信号途径的调控机理不清。

针对上述Notch研究所面临的障碍,我们在国际上首先建立了RBPJ的条件性基因剔除小鼠。这样,通过选择性导入Cre重组酶,即可通过RBPJ的突变实现Notch信号途径的剔除。我们之所以选择RBP-J为对象开展研究工作,是因为RBP-J是绝大多数Notch信号在核内的传递者,是整个Notch信号途径的调控的汇集点,RBP-J几乎可以反映Notch信号途径的功能。我们在这一领域进行了深入研究并取得了如下学术贡献。

1.首次成功地建立了转录因子RBP-J的条件性基因剔除小鼠模型并进行了初步分析。

RBP-J在共同淋巴祖细胞选择T/B细胞分化方向中发挥关键作用;②Notch-RBP-J信号途径是新生B细胞进入脾脏后确定分化命运的关键;③Notch-RBP-J信号途径在早期T细胞分化中起作用,剔除RBP-J造成T细胞分化的减少和T细胞分化的增加;④Notch-RBP-J信号途径在皮肤干细胞分化方向的确定上发挥关键作用。

2.首次揭示了Notch信号途径与PcG复合物之间的关系及其在Notch信号的转录记忆中的可能作用。PcG蛋白可以通过与KyoT2的相互作用抑制RBP-J的转录激活;而KBP1可以通过与KyoT2相互作用阻断PcG蛋白与KyoT2的结合,从而取消PcG通过KyoT2对转录因子RBP-J的抑制作用。由于PcG在果蝇中的功能是以表观遗传方式使细胞“记住”由Hox基因建立的细胞基因组转录模式及细胞分化状态,因此我们首次提出PcG可能通过KyoT2Notch-RBP-J信号通路建立的转录状态的记忆中发挥作用。

3MINTCRYBP的相互作用首次将Notch调控分子与软骨分化调控相联系,并解释了CRYBP抑制II型胶原增强子的分子机理。我们通过上述酵母双杂交筛选,发现转录因子CRYBP1可能与MINT相互作用。我们利用多种体内和体外实验方法证实了MINT可以与CRYBP1相互作用,并且用凝胶迁移实验和染色质免疫共沉淀实验(ChIP)证明MINT可以通过与CRYBP1的相互作用而被募集到II型胶原的增强子。进一步我们构建了报告基因载体系统,并且证明MINT可以通过与CRYBP1的相互作用抑制II型胶原增强子的转录激活。这种抑制作用依赖于组蛋白脱乙酰化酶活性,因此,MINT可能通过CRYBP1HDAC募集到II型胶原增强子从而抑制其转录激活。

以上研究对于深入探讨Notch信号途径对哺乳类发育和干细胞分化的调节作用具有十分重要的理论和实际意义。首先,由于转录因子RBP-J在哺乳类四种Notch受体的信号转导中发挥关键作用,所以我们建立的RBP-J条件性基因剔除小鼠为这一领域的深入研究提供了独一无二的模型。其次,我们利用这些动物模型进行的研究以及其他的分子生物学研究回答了Notch信号途径的功能和作用机理上的多个理论问题。基于我们建立的动物模型和相关分子研究,我们先后在淋巴细胞前体分化、新生B细胞分化以及皮肤干细胞分化中证实或首次发现了Notch-RBP-J信号途径的重要作用,并在一定程度上解释了RBP-J的调控机理。这些研究在发育、免疫以及干细胞领域都具有重要的理论意义。最后,Notch信号途径的异常在多种人类疾病的发病中发挥重要作用,如Notch3的突变已被判明为一种遗传性中风和痴呆(CADASIL)的致病原因,而EB病毒核抗原EBNA2的致瘤作用被认为是激活了RBP-J的结果。所以本研究对于这类疾病的发病机理的研究也具有重要意义。

近年来我们发表相关研究论文47篇,其中在国际杂志发表相关研究领域论文14篇,SCI收录的国内期刊7篇,共被引用220次。

第一完成人简介

韩骅,第四军医大学基础部医学遗传学与发育生物学教研室主任,教授、博士生导师。陕西医学遗传学会副主任委员,中国生物化学与分子生物学学会陕西分会常务理事,全军生物化学与分子生物学专业委员会委员,中国神经科学学会分子神经生物学专业委员会委员,中华医学会医学遗传学分会委员。长期从事生物化学、分子生物学和分子发育生物学的研究,在Notch信号领域进行了深入研究,获得了有重要创新价值的研究成果。近五年来承担国家杰出青年科学基金项目、国家自然科学基金重点项目、国家重点基础研究发展规划(973)项目、国家教育部跨世纪优秀人才基金项目等15项课题。获陕西省科学技术一等奖1项,中华医学科技三等奖1项。参编学术专著7部,SCI收录杂志上发表论文40余篇,其中第一作者或通讯作者在包括《自然免疫学》等著名刊物发表论文31篇。

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