完成单位：基础部
完 成 人：陈志南 朱 平 吴振彪 李 郁 李 玲 张 庆 续惠云
冯 强 骞爱荣 徐 静 张 征
获奖时间：2006年陕西省科学技术进步一等奖
项目简介：
HAb18G/CD147分子是本中心用肝癌抗体HAb18筛选HCC cDNA表达文库获得的一种新的跨膜糖蛋白，属于CD147家族新成员。经多种实验证实，它是诱导肿瘤转移、炎症发生、病毒感染的重要因子。本成果首次制备HAb18G/CD147这一新药靶的拮抗剂(抗体、多肽、siRNA)，进行以下三方面的研究和应用：
1. HAb18G/CD147拮抗剂抗肿瘤转移、复发意义重大
HAb18G/CD147拮抗剂经体内外实验表明，它是肿瘤复发转移的诱导因子，并可作为判断临床肝癌预后的标志物，其拮抗剂有较好的抗肿瘤侵袭作用。靶向药物获得国家生物制品I类新药证书后，进行了中晚期肝癌肝移植后抗复发治疗60例，其中30例为对照组，30例为抗体治疗组，与对照组相比，治疗组一年复发率降低了30.42%，生存率提高24.79%，AFP阴性维持率提高43.74%；临床扩大应用各期肝癌117例，临床缓解率9.15%，临床有效率31.2%，临床控制率90.11%，9月生存率93.17%，以上扩大临床结果表明该靶向药物抗肿瘤及复发、转移疗效明确。
2. HAb18G/CD147是诱导类风湿性关节炎（RA）等炎性疾病的重要因子
在组织、细胞、分子等不同水平分别发现HAb18G/CD147在RA关节滑膜组织、成纤维样滑膜细胞（FLS）、外周血细胞均高表达，并与MMP-1，2，3升高呈显著相关，其原理是该分子诱导成纤维细胞样滑膜细胞产生MMPs，促进骨、软骨侵蚀和血管翳形成。
另一发现是RA炎症关节高表达CD147配体CyPA，CyPA与CD147相互作用后可趋化单核、粒细胞、活化T细胞在关节病灶中聚集。RNA干涉后可抑制成纤维细胞样滑膜细胞MMPs的产生：治疗C57BL/6 CIA和DBA/1 CIA小鼠RA模型，抗体和拮抗肽均有较好效果。
3. HAb18G/CD147是病毒侵入细胞，感染复制的辅因子之一
本研究原创性发现HAb18G/CD147与CyPA相互作用易化SARS-CoV入侵宿主细胞，并发现HAb18G/CD147分子在HIV-1宿主细胞上高表达。其拮抗肽AP-9可特异性封闭其靶位，抑制了HAb18G、CyPA、SARS-Cov N蛋白或HIV-1 p24蛋白间的相互作用，发挥抗病毒感染宿主细胞作用。
立项背景：
CD147分子是广泛表达于造血及非造血细胞系，分子量为50～60kDa的跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族（IgSF）成员。人CD147分子曾有多种不同的命名，包括EMMPRIN、M6及我实验室命名的HAb18G，与小鼠Basigin、Gp42、大鼠OX-47、CE-9、鸡Neurothelin、HT7、5A11等不同种属抗原有较高同源性。CD147分子属单次跨膜糖蛋白，其蛋白组分的分子量为27KDa左右，编码269个氨基酸，21个氨基酸为信号肽，中间185个氨基酸构成胞外结构域，从206～229共24个氨基酸为穿膜区，C端39个氨基酸为胞内结构域。CD147的主要功能是诱导成纤维细胞产生多种基质金属蛋白酶（MMPs），而MMPs与胚胎发生、器官形态形成、骨重建、伤口愈合等有关。MMPs分泌紊乱与肿瘤转移、关节炎、动脉硬化、肝纤维化等疾病有关。因此，针对MMPs的抑制剂是医学研究领域的重点和热点之一。HAb18G/CD147在肝癌组织和细胞中特异性高表达，它选择性表达于肝癌组织中（75%），在正常肝组织低表达，在肝癌细胞HHCC、9204、7721的胞膜和胞浆呈阳性表达，而在胚肝细胞BEL-7402和正常肝细胞中表达阴性。免疫电镜分析CD147定位于肝癌细胞膜、内质网及一些管泡状结构的单位膜上。
原发性肝癌发病凶险、进展快，我国每年死亡人数为30万，其主要原因就是肝癌的高转移和高复发。肿瘤转移涉及诸多因素，其中基质金属蛋白酶最为重要。阻断CD147的功能就是阻断其刺激MMPs的分泌进而达到治疗肿瘤的目的。类风湿性关节炎（RA）在我国患病人数逾400万，致残率高。其临床特点为累及周身关节的增殖性和侵蚀性滑膜炎，发病机制迄今未明。目前应用的药物均不能终止软骨和骨侵袭，只能缓解病情和症状。近年来的研究发现，关节滑膜中巨噬细胞样滑膜细胞，滑液中的T细胞、单核-巨噬细胞、粒细胞通过高表达CD147分子，介导局部成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）大量产生MMP-1，2，3等，降解软骨和骨基质、促进滑膜细胞增殖和血管翳生成，最终导致软骨和骨破坏。
主要研究内容：
1．HAb18G/CD147分子及其拮抗药物抗肿瘤转移和复发
HAb18G/CD147肽类受体拮抗剂，是本项目组利用亲和纯化的HAb18G抗原多轮筛选噬菌体肽库，获得的9条高亲和性的12肽。用生物素标记HAb18G/CD147拮抗肽AP-1、AP-2和AP-6，用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测定AP-1、AP-2和AP-6与HHCC或SMMC7721细胞表面抗原HAb18G的亲和性。结果表明，AP-6与HHCC表面的HAb18G亲和力最强，AP-2次之，AP-1最弱。AP-6与SMMC7721表面的HAb18G的亲和力也最强，AP-1次之，AP-2未检测到。通过鸡胚绒毛尿囊膜模型，筛选AP-1、6、9可抑制鸡胚新生血管形成。用已获得的高亲和性肝癌膜蛋白单克隆抗体HAb18 IgG、HAb18 F(ab')2、同位素交联物131I-HAb18 F(ab')2，建立肝脏原位荷人高转移性肝癌MHCC97-H裸鼠动物摸型。结果显示各治疗组间荷瘤裸鼠体重无显著差异（P>0.05）。HAb18 IgG、HAb18 F(ab')2、131I-HAb18 F(ab')2低剂量组、高剂量组抑瘤率分别为35.7%、15.58%、60.92%和83.14%。统计学分析显示，与对照组相比，各组抑瘤率存在明显差异（P=0.0004）。用碘[131I]-HAb18 F(ab')2标记物（已被批准为国家生物制品一类新药），进行肝癌肝移植后病人的抗复发治疗，60例病人近期疗效对比分析结果表明，治疗后12月治疗组复发率为26.67%，对照组复发率为57.09%；治疗组生存率为82.50%，对照组生存率为61.88%；治疗组AFP阴转维持率为87.82%，对照组AFP阴转维持率为44.08%，差别均有统计学意义。
2．HAb18G/CD147分子及其拮抗药物抗RA的研究和应用
体外THP-1/RA患者外周血和滑液中MO/Mac细胞，与成纤维细胞共培养可明显增加MMP-2、9（包括酶原型、活化型），尤其是活化型MMP-2、9的产生，细胞侵袭力亦明显增强。拮抗肽AP-9 对MMPs的产生、细胞的侵袭力和趋化作用具有抑制作用。
建立抗CD147抗体和拮抗肽治疗DAB/1小鼠CIA和荷RA滑膜-正常软骨SCID小鼠动物模型。拮抗肽对关节软骨和骨侵袭以及血管翳形成的抑制作用的影响: ①通过大鼠佐剂关节炎模型证实AP-1、9可延迟发病，减轻关节病变及全身反应；②建立小鼠和大鼠胶原诱导关节炎（CIA）和荷人软骨和滑膜的SCID鼠，进行拮抗肽对软骨损伤的抑制作用和拮抗肽抗血管形成作用的实验。结果显示：拮抗肽AP-9、单抗HAb18均有较好的治疗效果。
3．HAb18G/CD147分子及其拮抗药物抗病毒感染
（1）HAb18G/CD147在SARS冠状病毒（SARS-CoV）入侵宿主细胞中的作用研究及应用。
采用免疫共沉淀法及生物传感器方法检测分析SARS-CoV结构蛋白、CyPA及HAb18G/CD147分子间的相互作用关系。发现尽管SARS冠状病毒S等结构蛋白不能与HAb18G/CD147分子直接结合，但其N蛋白可与CyPA结合，而CyPA可与HAb18G/CD147分子结合，提示CyPA介导了HAb18G/CD147分子与SARS冠状病毒间的相互作用。
采用病毒CPE法，在人胚肾传代细胞（293细胞）体外培养中，发现特异靶向HAb18G/CD147 的拮抗肽AP-9对293细胞的半数毒性剂量（TD50）在1 946.7μM以下。当加入100倍半数组织培养感染剂量（TCID50）的SARS冠状病毒后，293细胞感染坏死，而当最小治疗剂量（MIC）的AP-9加入感染细胞后，细胞形态逐渐恢复正常。证明AP-9对SARS-CoV具有明确的体外抑制作用。
（2）HAb18G/CD147在HIV-1入侵宿主细胞中的作用研究及应用。
检测CyPA与HIV-1结构蛋白间的结合动力学常数，结果显示HIV-1结构蛋白p24可与CyPA结合，而gp120、gp41则与CyPA无结合关系。采用免疫共沉淀方法分析HIV-1结构蛋白p24、CyPA与HAb18G/CD147分子间的相互作用关系，发现HIV-1结构蛋白p24可与CyPA结合，而CyPA可与HAb18G/CD147分子结合，提示CyPA介导了HAb18G/CD147分子与HIV-1病毒间的相互作用。流式细胞术分析发现，HAb18G/CD147分子在HIV-1易感细胞MT-4上高表达，表达率为93.56%，平均荧光强度101.84。激光共聚焦显微镜检测AP-9、HAb18G/CD147及CyPA的细胞学定位，结果显示AP-9可高度结合于MT-4细胞，两者均定位于感染细胞的细胞膜及胞浆中的同样位置。提示AP-9结合的是宿主细胞上的HAb18G/CD147分子。免疫电子显微镜亚细胞定位研究，发现CyPA定位于细胞膜及胞浆中；HAb18G/CD147为一跨膜分子，定位于细胞的单位膜上。胶体金双标记法显示，HAb18G/CD147与其拮抗肽AP-9在MT-4细胞上具有相同的亚细胞学定位，提示AP-9定位于HAb18G/CD147分子上。体外药效学研究显示，HAb18G/CD147分子拮抗肽AP-9能够在体外有效抑制HIV-1对宿主细胞的感染，AP-9对HIV-1诱导的细胞融合亦具有明确的抑制作用。
4．HAb18G/CD147拮抗肽的临床前研究
（1）急性毒性实验
采用Horn氏法对小鼠单次尾静脉注射进行最大耐受量实验，观察小鼠活动及死亡情况，连续14天。结果显示AP-9无明显毒性反应，小鼠活动正常，情况良好，最大耐受量为5 000mg/kg，相当于人常用量1 000倍。
（2）长期毒性实验
大鼠尾静脉注射AP-9，观察大鼠行为活动、体重、血液及生化指标改变，脏器重量及系数，病理组织及骨髓涂片等。结果显示，AP-9对大鼠行为活动、摄食量、体重、血液学指标均无特殊影响，雌性大鼠的谷草转氨酶（AST）呈剂量依赖性下降，雄性大鼠肌酐（CRE）呈剂量依赖性升高，甘油三脂呈剂量依赖性下降，AP-9的安全剂量为50mg/kg。
（3）安全药理实验
麻醉猕猴静脉注射AP-9，观察其心电图、平均动脉压、收缩压、舒张压、呼吸频率及呼吸幅度的变化；昆明种小鼠尾静脉注射AP-9，观察其自主活动及行为活动的变化。结果显示，AP-9在22.5mg/kg下对麻醉猕猴心血管、呼吸系统检测指标均无明显影响，0.5mg/kg下对小鼠自主行为活动无明显影响。
（4）血管刺激实验
健康家兔耳缘静脉注射AP-9，观察拮抗肽对血管的刺激性，结果显示，肉眼观察未见血管充血、淤血等刺激反应，病理组织学切片观察未见内皮细胞损伤与增生，也未见血栓形成、血管壁坏死等变化，表明AP-9在10mg/兔剂量下对家兔血管无刺激作用。
（5）呼吸道黏膜刺激实验
豚鼠呼吸道雾化吸入AP-9，结果示豚鼠经肉眼观察未见咳嗽、呼吸困难，病理组织学切片观察未见组织损伤，表明AP-9在20mg/只豚鼠剂量下对豚鼠呼吸道无刺激作用。
（6）全身致敏实验
豚鼠前肢静脉注射AP-9，14d、21d后再次攻击，结果显示在此剂量下，AP-9对豚鼠仅有轻微致敏作用（反应率30%）。
创新点
1．首次研制成功HAb18G/CD147拮抗剂，抗肿瘤转移、复发效果明确。该拮抗剂是肿瘤复发转移的诱导因子，可作为判断临床肝癌预后的标志物，其拮抗剂有较好的抗肿瘤侵袭作用。肝癌肝移植后抗复发治疗60例，治疗组一年复发率降低30.42%，生存率提高24.79%；临床扩大应用117例，临床缓解率9.15%，有效率31.2%。
2．HAb18G/CD147是诱导RA等炎性疾病的重要因子，是RA治疗的新药靶。在组织、细胞、分子等水平分别发现HAb18G/CD147在RA关节滑膜组织、成纤维样滑膜细胞、外周血细胞均高表达，并与MMP-1、2、3升高显著相关。动物体内实验首次证实高位阻断CD147可降低mmPs产生，减轻关节损害。
3．HAb18G/CD147是介导病毒侵入细胞、感染复制的辅因子之一。发现HAb18G/CD147与CyPA相互作用易化SARS-CoV入侵宿主细胞，并发现HAb18G/CD147分子在HIV-1宿主细胞上高表达。其拮抗肽AP-9可特异性封闭靶位，抑制HAb18G、CyPA、SARS-Cov N蛋白或HIV-1 p24蛋白间的相互作用，发挥抗病毒感染宿主细胞作用。
应用情况：
发表各类论文25篇，其中SCI论文11篇，被引用74次，获得国家发明专利授权1项，申请国家发明专利3项，培养硕士、博士研究生20名，博士后1名。所制抗体已广泛应用于全国大学、研究所、实验室，如天津医科大学肿瘤医院、四川大学华西医院等。HAb18G/CD147抗体靶向药物已在四川大学华西医院，四川省肿瘤医院，西安交通大学第一、二附属医院，陕西省肿瘤医院，第四军医大学第一、二附属医院，陕西省人民医院，四川省南充中心医院，武警总医院等十家三级甲等医院推广应用。累计病例763例，临床收益1 961.7万元，获成果转让费3 450万元。HAb18G/CD147分子及其拮抗剂的研究，提高了我国该领域的国际竞争力，推动了我国自主创新抗体药物的发展和产业形成，创造性地发展了HAb18G/CD147新药靶新功能，推动了我国多肽药物的研究和发展。
第一完成人简介：
陈志南，肿瘤细胞生物学与生物药学专家，中国工程院院士。第四军医大学细胞工程研究中心主任，教授、博士生导师。肿瘤生物学国家重点实验室学术带头人（PI）。中国细胞生物学会细胞工程与转基因生物分会会长，中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会主任委员，中国药学会生物化学与生物技术药物专业委员会副主任委员，国家生物产业发展专家咨询委员会专家，国家科技重大专项总体专家组专家，国家药典委员会委员。长期从事抗体工程/细胞工程等生物制药领域的研究。“八五”、“九五”承担国家“863”、“1035”工程新药研究重大项目，“十五”承担“创新药物与中药现代化”国家重大科技专项，是“十一五”肿瘤发生转移分子调控机制研究“973”项目首席科学家。近五年来，获国家发明专利授权11项，软件著作权2项，申请PCT国际专利4项；在Hepatology、J Biol Chem、Cell Mol Life Sci等SCI收录期刊发表论文54篇，主编专著5部；以第一完成人获国家科技进步二等奖、陕西省科学技术一等奖、军队科技进步一等奖各1项。
