完成单位：基础部
完 成 人：杨安钢 贾林涛 赵 晶 许彦鸣 张立红 于翠娟 王成济
裘秀春 桂俊豪 王立锋 苏成芝
获奖时间：2005年陕西省科学技术一等奖
项目简介：
本项目属于肿瘤生物治疗和免疫治疗的基础研究。erbB2/HER2/neu是一种在乳腺癌、胃癌、卵巢癌及肝癌等多种恶性肿瘤中广泛过表达的表皮生长因子家族受体。研究者借鉴细胞凋亡领域的最新研究成果，将抗肿瘤表面抗原HER2的单链抗体、来源于绿脓杆菌外毒素的膜转位肽段和活性半胱天冬酶（caspase）/粒酶B融合，构建靶向促凋亡蛋白及其表达载体。在体外实验中，用上述融合蛋白的基因修饰人T淋巴细胞系，使之在保持其生物学特性的同时，借助信号肽的作用持续分泌靶向促凋亡分子。将上述淋巴细胞与多种细胞系体外共培养，证实它们可以选择性地杀伤HER2阳性的肿瘤细胞，表明细胞分泌的靶向促凋亡蛋白可以借助抗体识别肿瘤细胞，内化并转位进入细胞液（cytosol）中，诱导肿瘤细胞凋亡。在动物实验中，建立HER2阳性肿瘤裸鼠模型，将分泌靶向促凋亡分子的淋巴细胞通过尾静脉注射输入荷瘤裸鼠体内，或者构建分泌型靶向促凋亡蛋白的真核表达载体和腺病毒载体，通过肌肉或瘤内注射使相应组织细胞分泌上述促凋亡蛋白，均可以有效地抑制体内肿瘤的生长，并显著延长裸鼠存活期。免疫组织学分析显示，分泌蛋白特异性地分布于肿瘤组织，而在正常组织中存在很少，表明这种由自身细胞分泌的靶向促凋亡分子可以通过血液循环到达全身各处，识别并杀伤原发和转移病灶区的肿瘤细胞。同时，淋巴细胞本身具有的向病变组织迁移、渗透以及在外周淋巴器官定居、归巢等特点，也有助于提高这种基因修饰细胞分泌的靶向促凋亡分子对肿瘤细胞的杀伤效率。本研究有望为特定抗原（如HER2）阳性肿瘤，尤其是转移肿瘤的基因治疗和免疫治疗提供一种新途径。
本研究在国际权威杂志Cancer Research（影响因子8.6）、Journal of Biological Chemistry（影响因子6.5）和Journal of Immunology（影响因子6.7）各发表论文1篇，在包括《科学通报》、《中华医学杂志》等在内的国内核心期刊发表论文15篇，论文被SCI收录9篇，申请国家发明专利2项。经检索国内外文献，目前尚未见与本研究思路相同的研究报道。
本课题受国家杰出青年科学基金、国家“863”计划项目、陕西省优秀留学回国人员（第四军医大学配套基金）和军队医药卫生科研基金重点项目支持。
肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病，世界上每年有500万人死于各种肿瘤，而每年新增肿瘤患者逾1 000万人。肿瘤的生物和免疫治疗是继放疗、化疗和手术治疗后出现的第四种肿瘤治疗模式。主要包括免疫治疗和基因治疗，其中前者以抗体类药物为主；后者通过将治疗基因导入体外培养的患者肿瘤细胞或其他组织细胞，进而回输这些细胞，或者通过适当载体将治疗基因直接转移进入体内组织细胞，使之在体内表达，杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。
免疫毒素属于抗体类药物，由抗体与 Ricin、PEA 或 DT 等毒素蛋白重组而成，它们可以杀伤识别的靶细胞。绿脓杆菌外毒素片段PE40是常用的毒素形式之一。免疫毒素对靶细胞的杀伤作用过程可以分为：抗体与受体结合→免疫毒素内化进入细胞内体→免疫毒素在内体内被furin识别剪切→杀伤分子转位至胞浆→杀伤分子发挥生物学功能引起细胞死亡等几个主要步骤。
20世纪90年代，我们提出了T细胞分泌免疫毒素杀伤肿瘤靶细胞的策略。该策略的核心内容是利用生物技术对T细胞进行基因修饰，使其可以稳定地以分泌形式表达免疫毒素。由于T细胞可以侵润到肿瘤内部，因而该策略能大大提高肿瘤内部免疫毒素的浓度，进而大大提高对肿瘤的杀伤作用。同时，由于T细胞本身不表达HER2，且免疫毒素是以分泌形式产生的，所以免疫毒素不会对分泌细胞产生杀伤作用。体内外实验证实这是一条行之有效的抗肿瘤策略。相关研究结果发表在了Nature和Nature Biotechnology。到目前为止，已有多种免疫毒素进入临床试验阶段，但尚未有获批准的免疫毒素上市。其重要原因是在临床试验阶段中发现免疫毒素能够引起患者机体的免疫反应，产生针对毒素片段的中和抗体，从而限制了免疫毒素的重复给药。为了解决这一问题，我们对免疫毒素进行了改造，用人活化形式的Caspase-3，6，7粒酶B或AIF替换了免疫毒素中的效应分子，构建了区别于免疫毒素的免疫促凋亡分子。HER2是表皮生长因子（EGF）受体家族成员，多种肿瘤组织都出现其基因扩增和过表达，包括乳腺癌、肺癌、胃癌和结肠直肠癌等，是一种公认的肿瘤标志物。HER2过表达的肿瘤病人预后差，表现在病程进展快、易转移和复发，病人生存期短。由于HER2是肿瘤治疗的理想靶位，我们构建了针对HER2阳性肿瘤细胞的免疫促凋亡分子。Caspase-3，6，7粒酶B，Bid和AIF等分子处于不同细胞凋亡通路的不同位置，它们共同的特点是活化后能高效引起细胞的凋亡，同时这些通路中的部分分子还可以放大凋亡信号。因此，用这些活化形式的人促凋亡分子替代免疫毒素中的杀伤分子在理论上是可行的。
研究内容：
细胞凋亡基因的克隆和靶向促凋亡基因的构建、促凋亡分子的活性研究、靶向促凋亡分子基因修饰淋巴细胞对体外培养的HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用和靶向促凋亡蛋白在小鼠体内抗肿瘤作用研究。
研究结果：
1．克隆了细胞凋亡基因并构建了靶向促凋亡基因，其中多种分泌型靶向促凋亡分子由信号肽－抗体－转膜多肽－活性凋亡分子组成。酶切和测序结果证实表达载体构建成功；
2．证实了PEA肽段/凋亡分子融合蛋白的促凋亡活性，瞬时表达PEA肽段/凋亡分子融合蛋白能引起分泌细胞的凋亡；
3．验证了靶向促凋亡分子基因修饰的淋巴细胞对体外培养的HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用。我们通过稳定转染获得了能够表达和分泌靶向促凋亡分子的人淋巴瘤Jurkat细胞株，淋巴细胞具有与未转染细胞相似生长特性，但是能持续稳定分泌免疫促凋亡分子，并能诱导与之共培养的HER2阳性肿瘤细胞的凋亡；
4．进行了靶向促凋亡蛋白基因体内抗肿瘤作用研究。我们建立HER2阳性肿瘤裸鼠模型，通过多种途径给药，研究对肿瘤生长和裸鼠存活期的影响，并对细胞分泌的肿瘤靶向促凋亡蛋白体内各组织分布检测、比较了不同治疗基因和不同给药途径的抗肿瘤效率。实验结果表明靶向促凋亡蛋白能在体内特异性杀伤肿瘤细胞，抑制其生长，延长荷瘤裸鼠的生存期。
本研究将抗肿瘤表面抗原HER2的抗体依次与膜转位结构域和活性凋亡蛋白融合，并用融合蛋白的基因修饰自体细胞，使之分泌目的蛋白，识别肿瘤细胞，内化和转位进入细胞液中，诱导细胞凋亡。因此，本研究建立了一种以特定肿瘤抗原（HER2）为靶点的基因治疗和免疫治疗新模式，丰富了肿瘤生物、免疫治疗的内涵，具有创新性的理论意义。
创新点：
1．提出利用天然蛋白质——绿脓杆菌外毒素的膜转位结构域作为转膜肽段，与肿瘤靶向抗体、促凋亡蛋白一起构建肿瘤靶向促凋亡分子，该分子特异地识别肿瘤细胞并内化进入细胞后，在转膜肽段的作用下，跨越内吞体等细胞器的脂质膜，转位进入细胞液中，导致细胞凋亡；
2．通过对淋巴细胞进行基因修饰，使之在保持正常的免疫学功能的同时，能够分泌产生肿瘤靶向促凋亡蛋白，由于淋巴细胞本身具有随淋巴循环迁移的特性，这种蛋白可以在全身范围内发挥作用，高效地识别和杀伤原发及转移病灶区的肿瘤细胞；
3．提出了以肿瘤靶向促凋亡为核心的给药途径多样的肿瘤基因治疗和免疫治疗方法，包括：①基因治疗的体内途径，即将肿瘤靶向促凋亡分子的真核表达载体或重组腺病毒导入肌肉或肿瘤组织局部，使相应组织细胞分泌该分子，在全身范围内抑制肿瘤生长；②基因治疗的体外途径，即通过肿瘤靶向促凋亡分子的基因修饰淋巴细胞并回输体内；③免疫治疗途径，即应用基因工程方法表达并纯化肿瘤靶向促凋亡分子，获得蛋白质制剂进行治疗。经文献检索，国内外均未见同样研究的报道。
本研究在国际肿瘤学权威杂志Cancer Research（影响因子8.6）、国际生物化学权威杂志Journal of Biological Chemistry（影响因子6.5）和国际免疫学权威杂志Journal of Immunology（影响因子6.7）各发表论文1篇，在包括《科学通报》、《中华医学杂志》等在内的国内核心期刊发表论文15篇，论文被SCI收录9篇，同时有2篇论文分别获得第六届和第七届“全军生物化学与分子生物学学术研讨会”优秀论文。这些研究论文均以国内单位作为通讯作者单位，具有独立的知识产权。此外，课题组已申请国家发明专利 2 项，其中 1 项已公开。
本课题取得的一系列重要研究结果，受到国内外学者的广泛肯定。Hepatology、J Cell Mol Med、J Exp Oncol、Pharmacol Rev、Cell Death Differ、J Clin Invest等国际知名期刊中均有他引文章发表。其中一篇在Pharmacol Rev发表的综述文章对我课题组的工作进行了详细的报道，另一篇发表于J Clin Invest（影响因子14.204）的文章也大篇幅引用了我们的研究结果。
本课题的研究成果具有广阔应用前景。HER2是一种在乳腺癌、胃癌、卵巢癌及肝癌等多种恶性肿瘤广泛过表达的受体，其过表达率在乳腺癌和卵巢癌中达到35%～40%，同时HER2的表达与肿瘤的恶性程度和转移能力密切相关。本研究有望形成三类针对HER2阳性肿瘤的基因治疗、免疫治疗产品或治疗方案：
1．体外基因修饰并回输患者外周血淋巴细胞的治疗方案：体外分离并通过分泌型肿瘤靶向凋亡蛋白基因修饰患者的淋巴细胞，经免疫磁珠筛选后进行静脉回输，使之在体内持续分泌目的蛋白，有效地杀伤原发和转移病灶区的肿瘤细胞，发挥长期的免疫监视作用。这一方案可以在大多数具有细胞培养条件的中心医院推广应用。
2．分泌型靶向凋亡分子重组腺病毒制品：由于腺病毒感染效率高，体外存活时间长，因此可以向常规药物一样运输和使用，通过瘤内和肌肉注射发挥肿瘤治疗作用。2003年，世界上第一个基因治疗产品重组腺病毒-p53（商品名为“今又生”）已经在我国问世，因此国内腺病毒制品中试生产的工艺和质量检定标准已经较为完备。同时，与上述产品相比，本研究通过重组腺病毒表达的目的蛋白具有良好的肿瘤靶向性，因此腺病毒感染正常细胞后也不会对细胞带来损害，而只是使之分泌肿瘤靶向杀伤蛋白，因此这种腺病毒制品的安全性更好。
3．基因工程抗肿瘤蛋白：通过大肠杆菌或真核细胞表达肿瘤靶向促凋亡蛋白，经过特定工艺纯化后获得蛋白质制剂，通过静脉或瘤内注射发挥免疫治疗作用。另外，在用其他抗体代替HER2抗体后，上述潜在治疗产品或治疗方案的适应证可以推广到其他肿瘤乃至其他疾病。总之，本项目的研究结果具有良好的推广应用前景，有助于我国在特定类型肿瘤等的治疗上形成自己的优势，可望实现良好的经济效益和社会效益。
第一完成人简介：
杨安钢，第四军医大学基础部免疫学教研室主任，教授、博士生导师。教育部“长江学者奖励计划”特聘教授，国家杰出青年科学基金获得者，中国生物化学与分子生物学学会医学分会副理事长，科技部“973”项目人口与健康领域咨询组专家，全军免疫学专业委员会副主任委员。主要从事肿瘤和病毒感染的免疫和基因治疗基础研究。承担国家“863”计划、国家自然科学基金重点项目、教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队项目等课题。获国家技术发明三等奖1项（排名第三）、陕西省科学技术一等奖2项（排名第一和第四）。主编专著2部。以第一或通讯作者发表论文200多篇，其中在国外SCI期刊发表论文30多篇。
