完成单位：基础部
完 成 人：陈志南 米 力 朱 平 邢金良 蒋建利 商 澎 边惠洁
刘彦仿 隋延仿 张思河
获奖时间：2005年国家科技进步二等奖
项目简介：
所属领域：药学与生物医学工程。
主要科技内容：（1）抗体制备、可变区基因克隆和工程抗体表达；（2）HAb18G/CD147靶分子的鉴定与功能研究；（3）碘[131I]美妥昔单抗注射液的研制及应用；（4）F(ab')2的制备、质控和细胞发酵；（5）靶分子拮抗肽的筛选及功能研究。
技术经济指标：（1）抗体：特异性强，肝癌组织高表达；亲和性高，Ka=6.32×10-10M；基因明确，VL421bp、VH445bp；抗原清楚，HAb18G/CD147分子；免疫组化，定位于胞膜及胞浆单位膜上。（2）碘[131I]美妥昔单抗注射液：质控，放化纯度>95%，免疫结合>50%，效期24h；安全有效，临床有效率27.4%，临床控制率86.3%，一年生存率70.2%，两年生存率42.18%。（3）工艺：细胞培养密度（1.2×107cells/mL）、抗体产量（550mg/L）、纯化回收率（>90%）。
促进行业科技进步：（1）首次研制成功自主产权的肝癌靶向药物，推动了我国抗体药物及生物产业的发展，并为临床难治性肝癌提供了新方法。（2）首次建立连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体工艺及培养工艺过程控制参数标准，建立单抗双、单段的制备纯化方法；编写“细胞培养用反馈补料控制软件”，推动了细胞工程行业的发展。（3）首次用HAb18G分子筛选随机肽库，获得9条特异性多肽，具有抑制肿瘤转移和病毒感染（如SARS-CoV、HIV-1）等功能，推动了我国多肽产业的发展，填补了病毒多肽药物的空白。
推广应用：免疫组化诊断试剂被全国普遍应用；该新药放免显像诊断270例，治疗239例，创收1 210万元；三项成果转让获6 650万元；论文被引用148次。
肝癌发病凶险，进展快，死亡率高，治疗效果差，我国是全球肝癌的高发区之一。世界卫生组织2003年度健康报告显示，肝癌发病率为23.7/10万人，全球每年有62万人死于肝癌，其中中国占45%，仅11%的患者可接受手术治疗。肝癌严重威胁着我国人民的生命和健康。肝癌现有治疗方法主要包括手术、化疗和放疗等。首选的方法是肝癌根治性切除术，但是由于发现的病例多属中晚期，手术切除率低，且复发率高。对于无手术适应症的患者可采用的另一种常用办法为导管动脉化学栓塞（TACE），但多年临床治疗发现其近期有效率不高（WHO：<20%），治疗后副作用较大，患者机体免疫和肝功能下降、耐药及术后高复发和转移是影响其疗效的主要原因。其它辅助治疗方法，包括放疗、射频消融、冷冻、注射无水乙醇等，疗效均不佳。肿瘤抗体靶向治疗以特异性好、亲和力强的抗体为靶向载体，以131I、90Y、188Re等具有电离辐射杀伤作用的同位素为弹头药物，交联组装成具有一定杀伤威力的抗癌制剂，具有良好的发展前景。至2004年，FDA已批准上市24种抗体药物，其中8种是抗肿瘤抗体药物。国内SFDA已批准上市10种抗体药物，其中5种是国外产品在中国进行注册和销售，5种为我国自主研发的抗体药物。相比国际水平，我国抗体药物发展较慢，缺乏源头创新产品，因此无论是发展生物制药/抗体药物产业，还是满足临床需求，都迫切需要加快肿瘤抗体药物的研究。
本成果的总体思路就是以HAb18G/CD147药靶系统为核心，制备靶向该分子的高特异性抗人肝癌单抗HAb18，交联放射性同位素131I制成碘[131I]美妥昔单抗注射液，通过肝动脉介入进行肝癌的局部放射免疫治疗。同时在上游研究靶分子HAb18G/CD147的序列、功能及参与肝癌的分子机制，分析HAb18单抗的基因序列和基因工程抗体改造以及HAb18G/CD147拮抗多肽的研发；在下游进一步开展大规模细胞培养工艺、F(ab')2制备及质量控制工艺。
碘[131I]美妥昔单抗注射液由特异性靶向高表达HAb18G/CD147的肝癌细胞抗体HAb18的F(ab')2段，与具有杀伤癌细胞作用的放射性同位素131I两部分交联而成。其抗肝癌的机制主要有两方面：一是靶向杀伤作用。碘[131I]通过β粒子直接杀伤癌细胞，同时其交叉火力效应，可以扩大杀伤半径，达到830μm，这种杀伤由于射线的穿透力无需内化即可实现；二是靶点封闭功能。抗体结合到肝癌细胞表面的HAb18G/CD147上时，还可封闭该靶点、阻断下游信号转导，达到抑制肝癌扩散和转移的目的。
主要研究内容：
第一部分，抗体制备、可变区基因克隆。
我们采用抗原性强、位点多、不易变异的新鲜肝癌手术切除组织标本作为免疫原，免疫小鼠制备杂交瘤，通过大量克隆和筛选获得在肝癌组织中高表达，在正常组织中极低表达或不表达的高特异性、高亲和性肝癌单抗HAb18。同时采用表达原核蛋白抗原-免疫动物-杂交瘤的方法，制备了其它抗HAb18G/CD147、CyPA、铁蛋白、羟化酶等重要分子的抗体51株。获得的HAb18特异性强、亲和力高，亲和常数为6.32×10-10M。HAb18G/CD147在肝癌组织的表达分布有较好特异性，选择性地高表达于肝癌组织，阳性率为75% (39/52)，正常肝组织极低表达或不表达。免疫电镜（胶体金）定位于肝癌细胞膜、内质网及一些管泡状结构的单位膜上。HAb18G/CD147在肝癌细胞系的表达表型为膜型和膜浆型。我们通过设计引物分别克隆了HAb18的轻、重链可变区基因VL和VH，并对该抗体基因申请了专利（专利号ZL02114471.0，PCT专利WO03078469进入美欧日等国家阶段）。
第二部分，荷瘤裸鼠实验治疗。
我们建立荷人肝癌裸鼠模型，分别经静脉注射HAb18、低剂量利卡汀和高剂量利卡汀，观察到相对于对照组，移植瘤的体积明显变小，而抑制效率方面，高剂量利卡汀>低剂量利卡汀>HAb18。动物体内实验的结果进一步证实了HAb18和利卡汀具有明确的抗肝癌疗效。
第三部分，美妥昔单抗质控和大规模细胞培养工艺。
碘[131I]美妥昔单抗注射液F(ab')2片段抗体的生产制备工艺，采用国际先进的搅拌式生物反应器悬浮培养工艺，最终细胞密度达1.6×107cells/mL，抗体产量达550mg/L；用扩张柱床SP阳离子吸附技术，一步回收培养上清中的IgG，回收率大于90%。整个生产工艺按GMP要求，建立了一系列无血清培养基悬浮流加培养规模化生产过程的GMP质量控制标准。通过中国药品生物制品检定所检定，同时研发了《细胞培养用反馈补料控制软件》（国家软件著作权号：2004SR11229）。
第四部分，碘[131I]美妥昔单抗注射液新药研制及应用。
我们首先进行了碘[131I]美妥昔单抗注射液的药效学实验、药代动力学实验、长期毒性实验等临床前研究。在I期临床研究中，先后完成了临床耐受性试验、临床药代动力学试验，验证了药物在体内应用的安全性和代谢过程。在II期临床研究中，我们评估了碘[131I]美妥昔单抗注射液经肝动脉介入注射治疗原发性肝癌的临床疗效及安全性，结果显示临床缓解率（CR+PR）8.22%，临床有效率（CR+PR+MR）27.40%，临床控制率（CR+PR+MR+SD）86.30%。AFP普遍降低。生存期统计分析，截止到2004年12月31日，中位生存时间为20个月，6个月生存率为82.80%，12个月生存率为70.20%，18个月生存率为51.90%，24个月生存率为42.48%，32个月生存率为31.03%。安全性评价结果提示，该注射液经肝动脉插管介入治疗原发性肝癌是安全的，该药物对心血管系统和肾功能几乎无影响。放射显影和腹部CT图片显示了几个疗效显著的病例，经治疗后肝癌原发灶明显缩小。
第五部分，HAb18G/CD147的鉴定与功能研究。
在研发抗体药物的同时，我们还开展了靶分子HAb18G/CD147的功能研究。我们用肝癌单抗HAb18筛选人肝癌细胞cDNA文库，克隆出编码HAb18G/CD147的cDNA片段，经查询Genbank，HAb18G/CD147与人CD147基因编码序列相同，均为免疫球蛋白超家族成员，基因定位于人19号染色体。HAb18G已被确认为CD147分子家族新成员。
在功能研究方面，我们进行了一系列的研究，包括明胶酶谱实验、抗侵袭实验、血管抑制试验、NO/cGMP-Ca2+信号转导实验、反义RNA及RNAi实验，结果提示HAb18G/CD147能诱导MMPs分泌、降解ECM、促进肿瘤转移。
第六部分，HAb18G/CD147拮抗肽筛选及功能研究。
我们采用亲和层析获得的HAb18G纯抗原筛选噬菌体随机肽库，获得9条特异性多肽（12肽），并对其进行了生物信息学理化特性的分析。拮抗肽对肝癌细胞HHCC和SMMC7721都具有一定的亲和性，明胶酶谱显示AP-1、6、9对FHCC98刺激成纤维细胞产生MMP-2激活过程具有明显的抑制作用。
创新点：
一、肝癌单抗HAb18（ZL02114471.0）：该抗体具有完整自主知识产权，特异性强，亲和性高，基因明确，抗原清楚，定位确切。
二、美妥昔单抗制备与放大工艺：在这方面我们获得了2项专利和1项软件著作权。大规模细胞培养工艺（ZL01131736.1），美妥昔单抗纯化工艺 （ZL99115730.3），反馈补料控制系统（2004SR11229，200510041698.X）。
三、肝癌单抗靶向药物（S20050039）：是世界首个特异性抗肝癌药物，具有靶向杀伤和靶点封闭的双重效应。
四、HAb18G/CD147新分子——新药靶：首次发现了新药靶HAb18G/CD147，并发现该分子在肿瘤转移、炎症发生、病毒感染中起到重要的作用。
五、HAb18G/CD147拮抗肽：基于对HAb18G/CD147的研究，研制了该分子的拮抗多肽，试验证明具有抑制肿瘤转移、抗炎、抗病毒的作用。
本项目获得授权专利5项，申请PCT专利3项、中国专利8项。已发表论文215篇，其中SCI论文24篇，影响因子累计66.476（其中5以上3篇，4以上2篇），PubMed收录26篇；EI收录1篇。论文被引用148次，其中被Nature Cell Biol、Gastroenterology、J Clin Oncol等高影响因子杂志引用11次。主编《细胞工程》、《抗体分子与肿瘤》、《重组抗体》、《激光扫描共聚焦显微镜技术》等4部专著。经评估，本项目的知识产权价值1.6750亿元，目前已转让成果3项：碘[131I]美妥昔单抗注射液，3 150万元（成都华神）；HAb18G拮抗多肽，2 500万元（上海美诺克）；西安细胞工程发展中心，1 000万元（陕高投）。
本项目取得的系列科研成果，提高了我国肝癌诊断治疗水平，推动了祖国医疗卫生事业的发展。HAb18及利卡汀先后在四川大学华西医院，四川省肿瘤医院，西安交通大学第一、二附属医院，陕西省肿瘤医院，第四军医大学第一、二附属医院，陕西省人民医院，四川省南充中心医院，武警总医院等多家大型医院应用推广。开展放射免疫显像诊断累计临床病例270例，临床治疗病例累计239例（484人次），临床治疗收益1 210万元。我们建立的与国际接轨的国家级研究基地和人才培养中心，培养了51名细胞工程/生物制药专业研究生，招收了30名生物工程专业本科生，培训了18名从事生物工程技术的高级技术人员。一定程度上缓解了我国相关人才紧缺的局面，推动了本学科的进步和发展。本项目取得的系列科研成果，提高了我国药物的整体研发水平，推动了我国生物制药产业的发展。建立的抗体药物制备工艺及放射免疫药物标记平台，填补了肝癌长期以来缺乏专用治疗药物的空白，推动了我国自主知识产权单抗药物研制进入国际先进行列，提升了我国在生物制药领域的国际竞争力。HAb18G/CD147分子为药物的发现建立了新方法、新思路，增添了世界生物医药领域的新药靶。建立的抗体药物放大技术平台，为我国生物制药行业标准的制订提供了依据。储备的抗SARS-CoV和HIV候选药物，推动了我国多肽药物的研究和发展。
主要完成人简介：
陈志南，肿瘤细胞生物学与生物药学专家，中国工程院院士。第四军医大学细胞工程研究中心主任，教授、博士生导师。肿瘤生物学国家重点实验室学术带头人（PI）。中国细胞生物学会细胞工程与转基因生物分会会长，中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会主任委员，中国药学会生物化学与生物技术药物专业委员会副主任委员，国家生物产业发展专家咨询委员会专家，国家科技重大专项总体专家组专家，国家药典委员会委员。长期从事抗体工程/细胞工程等生物制药领域的研究。“八五”、“九五”承担国家“863”、“1035”工程新药研究重大项目，“十五”承担“创新药物与中药现代化”国家重大科技专项，是“十一五”肿瘤发生转移分子调控机制研究“973”项目首席科学家。近五年来，获国家发明专利授权11项，软件著作权2项，申请PCT国际专利4项；在Hepatology、J Biol Chem、Cell Mol Life Sci等SCI收录期刊发表论文54篇，主编专著5部；以第一完成人获国家科技进步二等奖、陕西省科学技术一等奖、军队科技进步一等奖各1项。
